L'histoire du jeu se déroule neuf mois après les évènements concluant Arkham City et la mort du Joker, dont la crémation sert de séquence d'ouverture. La cité de Gotham connaît alors une ère de paix et la criminalité est au plus bas. Cependant, l’Épouvantail, présumé mort, provoque un carnage dans un restaurant avec sa nouvelle formule et menace d'inonder la ville de son gaz. La police est alors contrainte d'abandonner la ville et d'évacuer la population en 24 heures. Profitant de l'instabilité environnante, les plus grands criminels de Gotham encore en vie (tels Double-Face, L'homme mystere, Harley Quinn et le Pingouin) s'allient pour prendre le contrôle de la cité, la police étant en grave sous-effectif à cause de l'évacuation.

Après une brève rencontre avec Gordon sur le toit du GCPD, Batman commence sa traque de l'Épouvantail. Il retrouve Poison Ivy, retenue prisonnière par Crane après avoir refusé de se joindre à la coalition, n'ayant que peu d'intérêt à le suivre et parce qu'elle est immunisée contre la toxine. Guidé par Oracle, Batman pirate les antennes des studios de cinéma Panessa et de Falcone Shipping, et localise ainsi l'Épouvantail à l'usine chimique d'Ace Chemicals. Sur place, il découvre toute une armée, dirigée par le Chevalier d'Arkham, un mystérieux mercenaire qui semble le connaître et veut se venger de lui. Crane projette de faire exploser une bombe capable de propager sa toxine sur toute la côte Est ; Batman parvient à réduire la puissance de la bombe, tout en laissant s'échapper l'Épouvantail. Quant au Chevalier d'Arkham, il lance toutes ses forces dans Gotham et enlève Oracle.

Lors d'un flashback dans les studios Panessa où Batman a un repaire secret, on apprend que lors de l'incident d'Arkham City et la nuit du Protocole 10, le Joker lui avait injecté une dose de son sang ainsi qu'à d'autres personnes dans Gotham en envoyant des poches de sang contaminées aux hôpitaux. Malgré les efforts pour détruire ces poches, quatre personnes (Christina Bell, Johnny Charisma, Albert King et Henry Adams) ont été contaminées et depuis, se transforment physiquement et psychologiquement en Joker dans les cellules du repaire de Batman, pendant que Robin tente de trouver un remède définitif. Une cinquième connait une mutation plus lente : Batman lui-même qui n'a pas été totalement guéri par le remède de Mr Freeze.

Sous l'effet de la toxine qu'il a respirée et du sang du Joker, Batman commence sa « transformation » : le clown criminel lui apparaît ainsi sans prévenir, et lui parle, le nargue sans que le héros ne puisse s'en débarrasser. Il parvient à s'échapper de justesse d'Ace Chemicals, qui explose. Il lui faut maintenant sauver Oracle, et anéantir la menace que les troupes du Chevalier d'Arkham font peser sur Gotham. De retour au GCPD, il apprend à Gordon l'enlèvement de Barbara. Ils se rendent à la Tour de l'Horloge dans l'espoir d'y trouver des indices ; mais lorsque le commissaire découvre que sa fille était Oracle et qu'elle travaillait avec Batman, il rend ce dernier responsable, et refuse de continuer à collaborer avec lui. C'est donc seul que le Chevalier noir mène l'enquête.

Il suit les traces du véhicule du Chevalier d'Arkham, et se rend sur Miagani Island. Il infiltre le réseau de tunnels souterrains, dans lesquels le mercenaire a installé une base pour une partie de son armée. Au cours de cette deuxième rencontre, le mercenaire tire sur Batman et le laisse à ses soldats. Batman parvient à s'en tirer ; il apprend que c'est le Pingouin qui apporte les armes à la milice. Avec l'aide de Nightwing, il attaque le repaire de Cobblepot, qui lui apprend que l'Épouvantail travaille avec le milliardaire Simon Stagg. Batman pénètre dans les dirigeables de Stagg Enterprises, et découvre que Crane et Stagg ont mis au point un dispositif appelé le Déluge, une machine permettant une dispersion rapide et massive de la toxine de terreur. Quand il tente de capturer l'Épouvantail, l'esprit du Joker reprend le dessus, ce qui permet au Chevalier d'Arkham de fuir avec le Déluge ainsi qu'avec Crane. Batman reprend ses esprits et retrouve Oracle dans un repaire de l'Épouvantail ; mais sur place, il ne peut qu'assister impuissant au suicide de Barbara, soumise au gaz et délirant. Peu après, Batman retourne au GCPD pour demander de l'aide à Ivy. Elle se rend au jardin botanique pour réveiller et utiliser une plante ancestrale capable de purifier l'atmosphère, mais les tanks de la Milice veillent. Pendant ce temps, Harley Quinn infiltre les studios Panessa pour libérer les patients contaminés par le sang du Joker (pensant ainsi ressusciter le vrai Joker), mais dans sa folie, Henry Adams (qui se disait immunisé contre le sang du Joker) tue les autres, puis se suicide, en se rendant compte que Batman est lui aussi contaminé. Robin se rend également compte de la situation et n'a d'autre choix que d'enfermer Batman dans une cellule, refusant d'abandonner le combat tant que l'Épouvantail est libre.